超高效液相色谱串联质谱法测定海水鱼组织中甲

甲硝唑为硝基咪唑类药物，羟基甲硝唑为甲硝唑的代谢物，因疗效明显且价格低常被用于水产养殖，主要用于鱼类的常见滴虫感染，但由于硝基咪唑类化合物具有致癌、致畸和致突变等潜在的严重危害性[1-2]，许多国家和地区早已将其列入动物源性食品中禁止使用的化合物清单。我国也对硝基咪唑类进行了严格限制，甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑在动物性食品中不得检出。本实验建立超高效液相色谱-串联质谱法快速检测海水鱼组织中甲硝唑及其代谢物羟基甲硝唑残留量，以期为海水鱼中该组分的日常快速筛查与检验提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器

Agilent 1290超高效液相色谱仪；Agilent G6430型三重串联四级杆质谱仪；XA205DU电子天平(瑞士Mettler 公司)；3-18KS高速台式冷冻离心机（德国SIGMA公司）；SI-T256涡旋混合器；CPX5800H-C超声波清洗机；GH-100多功能回旋振荡器。

1.2 试剂

甲硝唑（批号：B0001888，含量99.5%，BePure），羟基甲硝唑（批号：，含量99.5%，WITEGA），甲醇、乙腈（色谱纯），所用水均为超纯水。

1.3 标准溶液的配制

分别精密称取标准物质约10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，配制成浓度为1 mg/mL的甲硝唑、羟基甲硝唑的标准储备液；分别准确移取100 μL标准储备液至另一100 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成1 μg/mL的混合标准中间液。

1.4 样品前处理

称取海水鱼均质试样5 g（精确到0.01 g），置于50 mL塑料离心管中，加入80%乙腈-水溶液10 mL，涡旋摇匀，超声波萃取1 min，回旋震荡萃取30 min, r/min高速离心5 min，取上清液直接加载到6 mL Waters Oasis PRiME HLB固相萃取小柱，无需活化和平衡，保持1滴/s的流速，收集全部流出液，精密移取 5.00 mL流出液，于40 ℃水浴氮气吹至小于0.5 mL，残留液体用10%乙腈-水定容至1.00 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，供超高效液相色谱-串联质谱法测定。

1.5 仪器条件

1.5.1 色谱条件

色 谱 柱ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相A为乙腈，B为0.3%甲酸-水溶液；流速0.2 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

1.5.2 质谱条件

采用电喷雾正电离源模式；扫描方式为多反应监测；雾化气压力30 psi；离子源温度300 ℃；干燥气流速：8 L·min-1；毛细管电压：4000 V；碎裂电压：165 V。质谱参数详见表1，各物质色谱图见图1。

表1 甲硝唑与羟基甲硝唑保留时间、定性定量离子对、碰撞能量化合物 保留时间/min定性离子对（m/z） 定量离子对（m/z）碰撞电压/V 碰撞能/V甲硝唑 4.330 172.0/128.0 172.0/82.0 95 20羟基甲硝唑 4.151 188.0/123.0 188.0/126.0 105 15

2 结果与分析

2.1 线性结果

使用海水鱼空白基质提取液和混合标准中间液，配制成质量浓度在1～100 ng/mL的基质混合标准曲线工作液，对其进行检测，结果如表2所示。在1～100 ng/mL浓度范围内甲硝唑、羟基甲硝唑色谱峰面积与浓度呈良好线性关系，相关系数均大于0.999，均满足检测的相关要求。

表2 线性回归方程及相关系数名称 线性回归方程 相关系数r2甲硝唑 Y= 0.羟基甲硝唑 Y= 0.

图1 甲硝唑和羟基甲硝唑对照的提取离子色谱图

2.2 空白试样、回收率与精密度

除不加试样外，按样品前处理的方法同法处理，获得空白试样，供液相色谱串联质谱测定。并向海水鱼组织阴性样品中添加一定量的目标化合物，对其进行回收率测定。称取9份阴性样品5.0 g（精确到0.01 g）置于50 mL具塞塑料离心管中，分别精密加入标准工作液，每3份为一组，制 成1.0、5.0、10 μg/kg 3个不同水平，按1.4项下进行处理，供超高效液相色谱-串联质谱法测定。经计算得出海水鱼组织中甲硝唑的回收率分别为86.8%、88.0%、91.2%，羟基甲硝唑回收率分别为97.9%、102.5%、101.5%，相对标准偏差为1.21%～4.30%，方法精密 度高。

2.3 方法的检测限与定量限

取空白海水鱼组织5 g（精确到0.01 g），置于离心管中，精密加入混合标准溶液中间溶液（1 μg/mL）10 μL，与样品前处理方法同法处理，依据特征离子质量色谱峰信噪比S/N=3为检测限，S/N=10为定量限进行计算，结果本方法的检出限如下，甲硝唑为0.2 μg/kg、羟基甲硝唑0.2 μg/kg，定量限甲硝唑为0.7 μg/kg、羟基甲硝唑为0.7 μg/kg，低于现行食品标准，均能满足兽药残留检测要求。

3 方法与标准对比

文章来源：《无损检测》 网址: http://www.wsjczzs.cn/qikandaodu/2021/0625/567.html